一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒

保存條件：

-20℃保存，FITC-dUTP需避光保存。如果經(jīng)常使用，FITC-dUTP和5×ReactionBuffer可放2-8℃保存。

產(chǎn)品簡介：

一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒為您提供了一種高靈敏度又快速簡便的細(xì)胞凋亡早期檢測方法。對于經(jīng)過固定和洗滌的細(xì)胞或組織，只要經(jīng)過一步染色反應(yīng)，洗滌后就可以通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測到凋亡細(xì)胞。

細(xì)胞在發(fā)生凋亡時，會激活一些DNA內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶會切斷核小體間的基因組DNA。基因組DNA斷裂時，暴露的3’-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)的催化下加上熒光素(FITC)標(biāo)記的dUTP(fluorescein-dUTP)，從而可以通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，這就是TUNEL(TdT--mediateddUTPNick-EndLabeling)法檢測細(xì)胞凋亡的原理。

操作步驟

1.a.對于細(xì)胞片或者冰凍切片,常規(guī)固定,PBS或HBSS洗滌3次（可選步驟：用含0.1％ Triton X-100的PBS孵育2分鐘。）。
b.對于石蠟切片,常規(guī)脫蠟透水,滴加20μg/ml蛋白酶K，20-37℃作用15-30分鐘(不同組織的*作用溫度和時間需自行摸索)。PBS或HBSS洗滌3次。注意：這一步必須把蛋白酶K洗滌干凈，否則會嚴(yán)重干擾后續(xù)的標(biāo)記反應(yīng)。

2．配制TUNEL檢測液：按比例,每個樣品,取10ul 5×Reaction Buffer,加入38ul ddH2O，加入1ul FITC-dUTP,加入1ul TdT酶,混勻。（如果zui后背景較深，可適當(dāng)減少FITC-dUTP和TdT酶）

3．在樣品上加入50μl TUNEL檢測液，37℃避光孵育30-60分鐘。配制好的TUNEL檢測液必須一次使用完畢，不能凍存。注意：孵育時需注意保濕,盡可能的在濕盒中孵育,以減少TUNEL檢測液的蒸發(fā)，如果標(biāo)本較小，可適當(dāng)?shù)臏p少試劑的用量。

4．PBS或HBSS洗滌2次。

5．用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察。可以使用的激發(fā)波長范圍為450-500nm，發(fā)射波長范圍為515-565nm(綠色熒光)。

6．對于懸浮細(xì)胞或細(xì)胞懸液：可以收集不超過10⁶個細(xì)胞，同樣固定，清洗，染色，清洗，zui后用250-500μlPBS或HBSS懸浮，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測或涂片后在熒光顯微鏡下觀察。

常見問題:

1．出現(xiàn)非特異性熒光標(biāo)記。
a．有些細(xì)胞或組織，例如平滑肌細(xì)胞或組織，nuclease或polymerase的酶活性水平較高，易導(dǎo)致出現(xiàn)非特異性的熒光標(biāo)記。解決方法是，取細(xì)胞或組織后立即固定并且要充分固定，以阻止這些酶導(dǎo)致假陽性。
b．使用了不適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ海缫恍┧嵝怨潭ㄒ海瑢?dǎo)致出現(xiàn)假陽性。建議采用推薦的固定液。

c．TUNEL檢測反應(yīng)時間過長，或TUNEL檢測反應(yīng)過程中反應(yīng)液滲漏，細(xì)胞或組織表面不能保持濕潤，也可能出現(xiàn)非特異性熒光。注意控制反應(yīng)時間，并確保TUNEL檢測反應(yīng)液能很好地覆蓋樣品。

2．熒光背景很高。
a．支原體污染。
b．高速分裂和增殖的細(xì)胞，有時也會出現(xiàn)細(xì)胞核中的DNA斷裂。
c．TUNEL反應(yīng)過強(qiáng)。減少酶和FITC-dUTP的加入量。
d．紅細(xì)胞中血紅蛋白導(dǎo)致的自發(fā)熒光產(chǎn)生嚴(yán)重干擾。此時宜選擇其它細(xì)胞凋亡檢測試劑盒。

3．標(biāo)記效率低。
a．使用乙醇或甲醇固定會導(dǎo)致標(biāo)記的效率較低。
b．固定時間過長，導(dǎo)致交聯(lián)程度過高。此時宜減少固定時間。

c．在加標(biāo)記液衣，可以用含0.1％ Triton X-100的PBS重懸細(xì)胞，冰浴孵育2分鐘。
d．熒光淬滅。Fluorescence在普通光照10分鐘就會嚴(yán)重淬滅。解決方法是需注意避光操作。
e．碘化丙啶雙染時，如果碘化丙啶染色過深會導(dǎo)致觀察到的本試劑盒的TUNEL染色效果減弱。碘化丙啶可以接受fluorescein激發(fā)產(chǎn)生的熒光，從而起到淬滅作用。解決方法是用較低濃度的碘化丙啶染色，例如0.5微克/毫升碘化丙啶。